綠色熒光蛋白GFP
日期：2025-06-07 11:51
瀏覽次數(shù)：1525
摘要：綠色熒光蛋白GFP，實驗表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性，去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸，GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低，而且形成過程受外界環(huán)境影響較大。
綠色熒光蛋白GFP
綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP）是在美國西北海岸所盛產(chǎn)的一種名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFP*早是在1962年由日本科學家下村修發(fā)現(xiàn)，是由238氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結(jié)構(gòu)顯示，蛋白質(zhì)中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm，寬240nm，由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于桶的大空腔內(nèi)。實驗表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性，去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸，GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低，而且形成過程受外界環(huán)境影響較大。
綠色熒光蛋白發(fā)光原理：
綠色熒光蛋白GFP的第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團。當?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團可進一步發(fā)生氧化脫氫，*終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結(jié)合，并*終自發(fā)催化形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。
綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大
綠色熒光蛋白發(fā)光特性：
GFP吸收的光譜*大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發(fā)射光譜*大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。
綠色熒光蛋白的應用：
廣泛應用于分子標記，體內(nèi)示蹤，信號轉(zhuǎn)導，**篩選等生物科研的各個方面。常用熒光蛋白的激發(fā)光源的選型LUYOR-3415RG
綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP）是在美國西北海岸所盛產(chǎn)的一種名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFP*早是在1962年由日本科學家下村修發(fā)現(xiàn)，是由238氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結(jié)構(gòu)顯示，蛋白質(zhì)中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm，寬240nm，由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于桶的大空腔內(nèi)。實驗表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性，去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸，GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低，而且形成過程受外界環(huán)境影響較大。
綠色熒光蛋白發(fā)光原理：
綠色熒光蛋白GFP的第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團。當?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團可進一步發(fā)生氧化脫氫，*終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結(jié)合，并*終自發(fā)催化形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。
綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大
綠色熒光蛋白發(fā)光特性：
GFP吸收的光譜*大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發(fā)射光譜*大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。
綠色熒光蛋白的應用：
廣泛應用于分子標記，體內(nèi)示蹤，信號轉(zhuǎn)導，**篩選等生物科研的各個方面。常用熒光蛋白的激發(fā)光源的選型LUYOR-3415RG